Citogenètica: Estudi de Cromosomes, Mutacions i Diagnòstic Genètic

CITOGENÈTICA: estudia l’estructura, la funció i el comportament dels cromosomes. En humans, s’aplica al diagnòstic i pronòstic d malalties genètiques. CROMOSOMA: És una estructura organitzada d’ADN i proteïnes q conté informació genètica. ESTUDI CITOGENETIC: S’analitza en metafase, quan el cromosoma està més compacte i visible al microscopi. ESTRUCTURA del cromosoma metafàsic CROMÀTIDES: Filaments idèntics units per cohesines, producte d la replicació d l’ADN. CENTRÒMER: Estrenyiment q divideix el cromosoma en 2 braços; conté el cinetocor, punt d’ancoratge del fus mitòtic. TELÒMERS: Extrems d les cromàtides, implicats en l’envelliment i el càncer. TIPUS d cromosomes CENTROMER: Divideix el cromosoma en braç curt (p) i braç llarg (q). INDEX CENTROMIC (IC): Relació entre la longitud del braç curt i la total del cromosoma. Tipus: Metacèntrics: Ic = 45-50 Submetacèntrics: Ic = 25-45 Acrocèntrics: Ic < 25 Telocèntrics: Ic = 0 NOMBRE d cromosomes DIPLOIDES (2n): 2 jocs cromosòmics, un d cada progenitor. HAPLOIDES (n): Un sol joc cromosòmic (gàmetes). HUMANS: 23 parelles d cromosomes (2n = 46), dels quals 44 autosomes i 2 sexuals (X,Y). IDIOGRAMA: Representació gràfica d’un cromosoma tenyit per identificar alteracions cromosòmiques. BANDATGE G: Tècnica més utilitzada per obtenir aproximadament 400 bandes en cromosomes metafàsics humans. CODI d LA BANDA: Cromosoma - braç - regió - banda. SUBBANDA: S’afegeix un punt i el número per codificar-les (per exemple, 1.1, 1.2, etc.).
Cromosomes en profase: Resolució més gran, fins a 550 a 850 bandes. MUTACIONS:  Definició: Canvis espontanis en la seqüència o estructura d l’ADN q modifiquen la informació genètica i poden alterar el fenotip. Mosaïcisme: Presència d dues o més poblacions cel·
Lulars amb genotips diferents, relacionada amb mutacions somàtiques i malalties neoplàsiques. Classificació: MUTACIONS GÈNIQUES definició: Afecten un o diversos nucleòtids, amb extensió reduïda.A) SUBSTITUCIONS són mutació puntual consisteix en substitució d'un nucleòtid per un altre. Mutació silenciosa: No afecta la proteïna sintetitzada. Mutació d sentit erroni: Provoca un canvi d’aminoàcid, com en l'anèmia d cèl·lules falciformes (canvi d’A per T). Mutació sense sentit: Genera un codó d terminació, resultants en una proteïna truncada i no funcional. INCERSIONS: Guany d nucleòtids. DELECIONS: Pèrdua d nucleòtids. Efectes: En un exó: Proteïna alterada, normalment no funcional. A les regions d tall i empalmament del pre-ARNm: Proteïnes alterades. En regions reguladores: Sobreexpressió, infraexpressió o silenciament. MUTACIONS CROMOSOMIQUES Definició: Afecten el nombre d cromosomes o l’estructura d grans regions d’un o diversos cromosomes. ALTERACIONS CROMÒSOMIQUES NUMÈRIQUES Poliploïdia: Més d 2 jocs cromosòmics complets (Triploïdia (3n): 3 dotacions cromosòmiques, Tetraploïdia (4n): quatre dotacions cromosòmiques. Aneuploïdia: Falta o excés d'un o diversos cromosomes (no un joc complet). Monosomia: Falta d'una cromosoma. Trisomia: Un cromosoma extra. Tetrasomia: Dues còpies addicionals d’un cromosoma. Alteracions cromosòmiques estructurals Deleció: Pèrdua d’un fragment cromosòmic. Pot ser: Terminal: Pèrdua en l'extrem del cromosoma. Intersticial: Pèrdua d’un fragment a l’interior del cromosoma. Al3 alteracions estructurals: Duplicació: Guany d material genètic. Inversió: Canvi d posició d'un fragment d cromosoma. Translocació: Transferència d’un fragment a un altre cromosoma. Cromosoma en anell: El cromosoma forma un anell. Isocromosoma: Una part del cromosoma és duplicada. Duplicació Definició: Repetició d'un fragment del cromosoma. Localització: En tàndem: El fragment repetit està immediatament a continuació d l'original. Desplaçada: Els fragments repetits estan separats per una altra regió del cromosoma. Orientació: Directa: La mateixa orientació q l’original. Invertida: Orientació inversa respecte a l’original. Inversió Definició: Un segment cromosòmic canvia d'orientació, situant-se invertit respecte a la posició normal. Tipus: Pericèntrica: Inclou el centròmer. Paracèntrica: No inclou el centròmer. Translocació Definició: Intercanvi d fragments cromosòmics entre cromosomes no homòlegs. Tipus: No recíproca: Només un cromosoma transfereix material genètic. Recíproca: Els 2 cromosomes intercanvien material genètic. Robertsoniana: Translocació especial entre cromosomes acrocèntrics. Cromosoma en anell Definició: Anomalia cromosòmica causada per una doble eliminació terminal i la circularització d la resta del cromosoma. Isocromosoma Definició: Cromosoma amb els 2 braços iguals i orientats d manera invertida, com una imatge especular del centròmer. Nomenclatura citogenètica i fórmula cromosòmic Anomalies numèriques Cromosomes sexuals: Es reflecteixen directament a la fórmula cromosòmica. Monosomies: Falta d’un cromosoma, s’indica amb el signe - seguit del número del cromosoma. Ex: 47,XX,-21 (monosomia del cromosoma 21). Trisomies: Excés d’un cromosoma, s’indica amb el signe + seguit del número del cromosoma. Ex: 47,XX,+21 (trisomia 21, síndrome d Down). Exemples d fórmules cromosòmiques Sense anomalies: Dona: 46,XX Home: 46,XY Anomalies en cromosomes sexuals: Monosomia del cromosoma X: 45,X Disomia del cromosoma Y: 47,XYY Anomalies en autosomes: Monosomia del cromosoma 21 en una dona: 45,XX,-21 Trisomia del cromosoma 21 en un home: 47,XY,+21 Anomalies estructurals Alteracions en un únic cromosoma Deleció: Pèrdua d'un fragment cromosòmic. Ex: 46,XX,del(9)(q22) Dona amb deleció terminal del braç llarg del cromosoma 9, punt d trencament a q22. Exemple: 46,XY,del(2)(q21q32) Home amb deleció intersticial del cromosoma 2, trencament a q21 i q32. Duplicació: Repetició d'un fragment cromosòmic. Exemple: 46,XX,dir dup(3)(p12p22) Dona amb duplicació directa en tàndem des d p12 fins a p22 al cromosoma 3. Inversió: Canvi d'orientació d'un fragment cromosòmic. Exemple: 46,XY,inv(4)(p22p28) Home amb inversió del cromosoma 4, punts d trencament i reuníó a p22 i p28. Cromosoma en anell: El cromosoma forma un anell després d la pèrdua d segments terminal. Exemple: 46,XX,r(10)(p14q25) Dona amb el cromosoma 10 en anell, trencament i reuníó a p14 i q25. Alteracions en 2 cromosomes (Translocacions) Translocacions no recíproques: Un cromosoma transferix material genètic a un altre. Exemple: 46,XY,ins(10;3)(q22;p13p23) Home amb inserció en cromosoma 10 a q22, amb segment del cromosoma 3 entre p13 i p23. Translocacions recíproques: Intercanvi d material genètic entre 2 cromosomes. Exemple: 46,Y,t(X;17)(q23;q21) Home amb translocació recíproca entre cromosomes X i 17, intercanvi a Xq23 i 17q21. Exemple: 46,XX,t(9;10)(q32;p14) Dona amb translocació recíproca entre cromosomes 9 i 10, intercanvi a 9q32 i 10p14. MOSAICISME : Els mosaïcismes es descriuen amb l'abreviatura "mos", seguit d les línies cel·lulars anormals i normals, separades pel signe "/". També s’indica el nombre d metafases analitzades entre claudàtors. Les línies cel·lulars anormals es disposen d més gran a més petit segons el nombre d metafases en què s’han detectat. Exemple mos47,XYY,[15]/46XY[30] Descripció: Un individu amb mosaïcisme on s'han analitzat 45 metafases. Explicació: 15 metafases mostren una disomia del cromosoma Y (47,XYY). 30 metafases són normals (46,XY). Cen: Centromèrit, pter: Telòmer del braç curt, chr: Cromosoma, q: Braç llarg, del: Deleció, qter: Telòmer del braç llarg, dup: Duplicació, r: Cromosoma en anell, dir: Directa, rob: Translocació robertsoniana, i: Isocromosoma, t: Translocació, ins: Inserció, ;: Separació entre cromosomes, inv: Inversió, +: Augment en el nombre d cromosomes, mos: Mosaïcisme, -: Disminució en el nombre d cromosomes, p: Braç curt, /: Separació entre línies cel·lulars d mosaic o quimeres Anàlisi Cromosòmica: Objectiu principal: Recompte i anàlisi d cromosomes en metafases completes per crear un cariotip.
Aquest procés implica l'ordenament i aparellament dels cromosomes basats en les seves característiques morfològiques. Mínim d metafases per analitzar: Per crear un cariotip normal, es necessiten mínim 20 metafases completes visualitzades amb objectiu 100x. En casos d mosaïcisme (diferents cariotips en diferents poblacions cel·lulars), s'analitzen mínim 30 metafases per tenir una representació precisa. Característiques morfològiques per ordenar els cromosomes: Mida: S'ordenen d més gran a més petit. Posició del centròmer: Els cromosomes es classifiquen com a metacèntrics, submetacèntrics o acrocèntrics segons la posició del centròmer. Presència d constriccions secundàries: Alguns cromosomes presenten constriccions secundàries q s’utilitzen per l'ordenament. Grups d cromosomes en el cariotip humà: Vuit grups d cromosomes: Set grups d'autosomes (A-G) i un grup d cromosomes sexuals (X i Y). El cromosoma X és submetacèntric mitjà i el cromosoma Y és acrocèntric petit. El cromosoma Y, per morfologia, hauria d’estar al grup G. Patró d bandes G: El patró estàndard és d 350-400 bandes. Aquest patró ajuda a detectar i analitzar alteracions estructurals dels cromosomes, facilitant la identificació d'anomalies. Automatització d l'anàlisi cromosòmica: Utilització d plataformes d’anàlisi d’imatge (cariotipadors). Captura i anàlisi d'imatges d metafases, classificació automàtica dels cromosomes segons morfologia i patró d bandes. Elaboració automàtica del cariotip i informe amb les alteracions detectades. Introducció al Cariotip i Visualització dels Cromosomes Cariotip: Definició: El cariotip és el conjunt d cromosomes d’una espècie, individu o cèl·lula ordenats per mida i morfologia. Tipus d cariotips: Cariotip d’espècie: Caracteritza una espècie i s’utilitza per detectar mutacions i anomalies. Cariotip constitucional (d'individu): Conjunt d cromosomes representatiu d l’individu, el cariotip amb què neix una persona. Cariotip d cèl·lula: Cèl·lules individuals, com les tumorals, poden tenir cariotips diferents dels d l’individu. Cariotip humà: L'espècie humana és diploide (2n = 46 cromosomes). 22 parelles d'autosomes (1-22) i 1 parella d cromosomes sexuals (XX en dones, XY en homes). Visualització dels Cromosomes: Moments d visualització: Els cromosomes es poden observar millor durant la profase i metafase, quan estan altament condensats. Tècniques d tinció: Tinció convencional: Utilitza Giemsa o orceïna per tenyir uniformement els cromosomes. No detecta anomalies estructurals. Bandatge cromosòmic: Permet identificar cromosomes i detectar anomalies estructurals. Inclou diverses tècniques. Tècniques d Bandatge Cromosòmic: Bandatge G: Giemsa + tripsina: Genera bandes fosques (G+) i clares (G-). Les bandes fosques corresponen a regions d’ADN riquíssimes en AT i GC. Bandatge R: Revers del bandatge G: S’obté un patró invers (negatiu). Es fa incubant a 85°C i després tenyint amb Giemsa. Bandatge Q: Utilitza quinacrina per obtenir un patró fluorescent. Les bandes brillants corresponen a les bandes G+. Bandatge C: Tècnica específica per tenyir regions riques en heterocromatina i centròmers.Els cromosomes es tracten amb àcid clorhídric, hidròxid d bari, calor, i finalment es tenyixen amb Giemsa. Tècniques d Tinció i Bandatge Cromosòmic Tinció Convencional: Procediment: Colorant: Solució d Giemsa al 3% en tampó fosfat a pH 6,7. Temps: Immersió durant 3-4 minuts, seguida d’un rentat amb aigua. Resultat: Els cromosomes es tenyeixen d manera uniforme, però no detecta anomalies estructurals. Bandatge G: Envelliment: Preparacions han d ser envellides abans d la tinció. Temperatures d’envelliment: 60-65°C durant 1-2 dies. 37°C durant 3-4 dies. Temperatura ambient durant 7-10 dies. Procediment d Tinció: Passos: Digestió amb tripsina: Descomposa proteïnes per millorar la tinció. Tinció amb Giemsa: S’utilitza per tenyir els cromosomes. Finalització: Rentat amb aigua i assecat per a l’anàlisi microscòpic. Cariotip d'alta resolució Definició:  El cariotip d'alta resolució s'obté a partir d cromosomes en profase tardana o prometafase. Aquest procés permet una visualització més detallada dels cromosomes amb una resolució més alta q en la metafase. Resolució: El grau d condensació dels cromosomes és menor q en metafase, el q permet obtenir més bandes (entre 500 i 850 bandes) utilitzant tècniques d bandatge G. Sincronització del Cultiu Cel·Per garantir la presència d cromosomes en profase o prometafase, es realitza una incubació curta durant el procés d cultiu. Aplicacions d la Citogenètica: Diagnòstic Prenatal Situacions indicades per a la citogenètica prenatal: Resultat alterat del triple cribatge (bioquímic i ecogràfic) en el primer trimestre d gestació. Retard en el creixement intrauterí. Anomalies ecogràfiques en el fetus. Antecedents d cromosomopaties equilibrades en un progenitor. Tipus d mos3 per al cariotip fetal: Vellositat coriònica (d'entre les setmanes 10 i 14 d gestació). Líquid amniòtic (entre les setmanes 16 i 18 d gestació). Cariotip d Vellositat Coriònica Procediment: Biòpsia: Es fa per via transcervical o transabdominal, amb control ecogràfic. Avantatge: Permet diagnòstic prenatal primerenc (primer trimestre). Inconvenients: Pot generar mosaïcismes per contaminació materna i qualitat variable d les metafases. Cultiu i obtenció d metafases: Cultiu curt (24-48 hores): S'afegeix colquicina/Colcemid™ per aturar la mitosi. Es fa xoc hipotònic per afavorir la ruptura cel·lular. Fixació i rentades amb àcid acètic i alcohol. Tècnica d degoteig en portaobjectes. Tècnica d tinció G per identificar les bandes cromosòmiques. Cultiu llarg (4-5 dies): Disgregació enzimàtica d la vellositat (amb pronasa i col·lagenasa). Control d creixement mitjançant microscopi. Mitosi en metafase amb colquicina/Colcemid™. Xoc hipotònic i fixació similar al cultiu curt. Tècnica d tinció G. Cariotip d Líquid Amniòtic Obtenció del líquid amniòtic: Es fa per punció transabdominal amb control ecogràfic, normalment entre les setmanes 16 i 18 d gestació. Procediment: Centrifugació del líquid amniòtic per separar les cèl·lules. Resuspensió del botó cel·lular en medi d cultiu complet. Sembra en plaques d Petri o flascons d Roux. Segueix el mateix procediment q el cultiu llarg d vellositat coriònica (control d creixement, xoc hipotònic, fixació, etc.). Citogenètica i Càncer Relació entre alteracions cromosòmiques i càncer: Alteracions cromosòmiques (numèriques i estructurals) són la causa d moltes neoplàsies. Els mecanismes mitjançant els quals les alteracions cromosòmiques desencadenen el càncer són variats, però els més rellevants són: Translocacions i inversions: Activació o sobreexpressió d’oncogens. Genes d fusió: Creació d proteïnes quimèriques q alteren la funció d gens implicats en el creixement cel·lular. Exemple d translocació: Cromosoma Philadelphia. Translocació recíproca entre els cromosomes 9 i 12. Resultat: Sobreexpressió d l’oncogen ABL sota el control del gen BCR. Deleccions i aneuploidies: Pèrdua d cromosomes: Pot resultar en la pèrdua d gens supressors d tumors. Guany d material genètic: Pot provocar la sobreexpressió d’oncogens. Evolució del tumor: Els tumors evolucionen amb la formació d subclons cel·lulars q acumulen alteracions genètiques addicionals. Cicle Cel·lular: Principi d Paretó 1. Definició i Conceptes Clau: Cicle Cel·lular: Conjunt d'activitats i canvis d'una cèl·lula des d la divisió d'una cèl·lula parental fins a la formació d dues cèl·lules filles. Es divideix en Interfase i Mitosi. 2. Interfase (Període entre dues mitosis consecutives): G1: Creixement cel·lular. S: Replicació d l'ADN. G2: Producció d proteïnes per a la divisió cel·lular. 3. Mitosi (Fase M, divisió d la cèl·lula): Profase: Condensació d cromatina. Formació d cinetocors. Separació dels centrosomes. Formació del fus acromàtic. Desaparició d la membrana nuclear. Metafase: Cromosomes alineats a la placa equatorial. Anafase: Separació d les cromàtides germanes. Arribada d les cromàtides als pòlss cel·lulars. Telofase: Desapareix el fus acromàtic. Nova membrana nuclear al voltant d cada conjunt d cromosomes. Descondensació dels cromosomes. Citocinesi: Repartiment del citoplasma i els orgànuls entre les cèl·lules filles.