Cinética Enzimática y Factores Determinantes de la Actividad Catalítica: Estudio de la Beta-Glucosidasa

Fundamentos de la Actividad Enzimática

Definición y Mecanismo de Acción

Las Enzimas son proteínas con actividad catalítica, ya que aumentan la velocidad de una reacción química, permitiendo así que el sustrato se transforme en producto de manera más rápida. La enzima se une al sustrato formando el complejo Enzima – Sustrato (E-S). Una vez que se ha formado el nuevo producto, la enzima se separa de este, quedando libre para recibir a otra molécula de sustrato.

Cuantificación de la Velocidad de Reacción

La velocidad de las reacciones se determina de acuerdo al aumento de la concentración del producto o a la disminución de la concentración del sustrato de la reacción en el tiempo.

Métodos de Cuantificación

Existen métodos que permiten cuantificar la concentración de reactantes y/o productos. Entre los métodos físico-analíticos, están los ópticos, que se basan en la absorción de radiación electromagnética en la región visible y ultravioleta. Determinando el coeficiente de extinción de un compuesto, se estima la velocidad sobre la base de las medidas experimentales de absorbancia a un tiempo dado.

Factores que Afectan la Actividad Enzimática

Hay diferentes factores que afectan la actividad de las enzimas. Los factores más importantes son:

• Concentración de enzima
• Concentración de ligandos
• pH
• Fuerza iónica
• Temperatura

Efecto del pH

La actividad de las enzimas se ve notablemente afectada por el pH del medio. Los catalizadores biológicos son solo activos en un rango limitado, observándose una zona de pH óptimo y una disminución de la actividad enzimática a ambos lados del pH óptimo.

El efecto del pH en la actividad enzimática se debe a cambios en el estado de ionización de los componentes del sistema; esto puede darse en la enzima libre, en el complejo E-S o en el sustrato. En la zona de pH óptimo, predomina la forma iónica activa; a valores extremos de pH, su proporción disminuye, aumentando la proporción de formas iónicas no activas. El pH no solo afecta la actividad de las enzimas, sino que también su estabilidad, lo que contribuye a la disminución de la actividad, generalmente a valores extremos de pH.

Efecto de la Temperatura (T°)

Respecto a la temperatura, hay dos factores determinantes: el efecto de la temperatura en las constantes de velocidad de la reacción y el efecto de la temperatura en la estabilidad de la enzima.

Al igual que sucede con los catalizadores químicos, un aumento de la temperatura aumenta la velocidad de la reacción; sin embargo, sobre cierta temperatura hay inactivación de la enzima, lo que conlleva a una disminución en la velocidad de reacción. La zona de temperatura en la cual se observa la mayor actividad enzimática se conoce como “temperatura óptima”. Esta tiene solo valor operativo, ya que depende de una serie de factores, como el pH y el tiempo de reacción.

Características de la β-Glucosidasa de Almendra

La β-glucosidasa de almendra presenta un pH óptimo de catálisis entre pH 4 y pH 5. El rango de temperatura óptima abarca desde los 15 ºC hasta los 50 ºC, donde la mayor actividad se registra a 40 ºC. Presenta una alta eficacia catalítica al usar pNPG (p-nitrofenil-β-D-glucopiranósido).

Ensayo de Actividad Enzimática: Determinación de la Actividad β-Glucosidasa (Método Discontinuo)

El procedimiento general para el ensayo es el siguiente:

1. Se pre-incuba 0,9 ml de pNPG 2 mM disuelto en el tampón apropiado durante 3 min. a 40 ºC.
2. Se inicia la reacción al adicionar 0,1 ml de extracto enzimático.
3. La reacción se detiene después de 5 minutos con 0,2 ml de Na₂CO₃ 1M.
4. El p-nitrofenolato producido se lee a 405 nm y se determina su concentración en una curva estándar de p-nitrofenolato.

A) EFECTO DE LA TEMPERATURA

Se preparan tres tubos con concentraciones constantes de enzima y sustrato, a un valor de pH apropiado (pH = 5,0), y se incuban a diferentes temperaturas un tiempo determinado.

1. Transcurrido el tiempo de incubación, se detiene inmediatamente la reacción, agregando el carbonato de sodio.
2. Se mide la absorbancia de cada tubo a 405 nm.

Blanco para Efecto de la Temperatura

Se emplea el blanco para calibrar el espectrofotómetro. Se prepara con 0,9 ml de sustrato más 0,2 ml de Na₂CO₃ y, por último, 0,1 ml de enzima.

B) EFECTO DEL pH

Se preparan los tubos empleando concentraciones constantes de enzima y sustrato a diferentes pH; se incuban a la temperatura determinada como óptima por 5 min.

1. Se detiene la reacción agregando a cada tubo 0,2 ml de carbonato de sodio 1,0 M.
2. Leer la absorbancia a 405 nm en el espectrofotómetro.

Blanco para Efecto del pH

Para cada pH debe prepararse un blanco. Se prepara con 1 ml de sustrato más 0,2 ml de Na₂CO₃ y, por último, 0,1 ml de enzima.