Biosensores de ADN: Fundamentos, Aplicaciones y Técnicas de Detección

Biosensores de ADN: Principios y Aplicaciones

Biosensores Basados en la Hibridación del ADN

Los biosensores que emplean ADN se fundamentan en el principio de la hibridación de moléculas de ADN. Se utilizan para reconocer y cuantificar secuencias de ADN diana en muestras problema. Estos biosensores emplean marcajes específicos, como fluorocromos o enzimas, para detectar la hibridación de secuencias complementarias. Aunque útiles, los biosensores de ADN a menudo requieren una amplificación previa de las moléculas diana mediante la técnica de PCR para aumentar su sensibilidad.

PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa): Amplificación de ADN

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es un método fundamental en el análisis de ácidos nucleicos. Permite amplificar exponencialmente un fragmento específico de ADN o ARN a partir de una pequeña cantidad de material inicial, que actúa como molde. La PCR se basa en la amplificación enzimática de un fragmento de ADN delimitado por dos secuencias de oligonucleótidos, conocidos como cebadores o primers. Estos cebadores hibridan con las cadenas complementarias de la molécula molde y son utilizados por una enzima ADN polimerasa termoestable para copiar la secuencia.

Componentes de la Reacción de PCR

• Tampón de reacción (Tris): Proporciona un pH adecuado (generalmente 8,4) para la actividad enzimática.
• Primers o cebadores específicos: Secuencias cortas de oligonucleótidos que flanquean el fragmento de ADN que se desea amplificar.
• Desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs): Son los "ladrillos" que la ADN polimerasa utiliza para sintetizar la nueva cadena de ADN. Pueden estar marcados con isótopos radiactivos (³²P), quimioluminiscentes o fluorescentes para facilitar la detección del producto de PCR.
• ADN polimerasa termoestable: Enzima clave que cataliza la polimerización de la nueva cadena de ADN en dirección 5' → 3'. Esta enzima es capaz de resistir las altas temperaturas necesarias para la desnaturalización del ADN.
• Muestra de ADN: El material genético que se va a analizar y que contiene la secuencia diana a amplificar.

Etapas de la PCR: Ciclo Térmico

La PCR se lleva a cabo en un termociclador, un aparato que automatiza los cambios de temperatura necesarios para cada etapa del proceso. Un ciclo típico de PCR consta de tres etapas:

1. Desnaturalización (Melting): La muestra de ADN se calienta a una temperatura elevada (generalmente 94-98°C) para separar las dos hebras de la doble hélice y obtener moléculas de ADN de cadena sencilla.
2. Hibridación (Annealing): Se reduce la temperatura (generalmente entre 50-65°C, dependiendo de la secuencia de los cebadores) para permitir que los cebadores se unan específicamente a sus secuencias complementarias en el ADN molde. Temperaturas incorrectas pueden resultar en hibridaciones inespecíficas o en una baja eficiencia de la reacción.
3. Extensión (Elongation): La temperatura se eleva a la temperatura óptima de la ADN polimerasa termoestable (generalmente 72°C para la Taq polimerasa). La polimerasa extiende los cebadores, incorporando nucleótidos complementarios al molde y sintetizando una nueva cadena de ADN.

Detección, Cuantificación e Identificación de ADN

Tras la amplificación por PCR, los fragmentos de ADN resultantes pueden analizarse mediante diversas técnicas para detectar secuencias específicas, cuantificar la cantidad de ADN presente o identificar variantes genéticas. Entre estas técnicas se encuentran la hibridación con sondas y la electroforesis en gel.

Técnicas de Hibridación

Las técnicas de hibridación se basan en la unión de una sonda de ADN monocatenario marcada (radiactiva o fluorescentemente) a una secuencia de ADN complementaria. Existen varios tipos:

1. Southern Blot: Se utiliza para detectar secuencias específicas de ADN. El ADN se separa por electroforesis en gel, se transfiere a una membrana de nitrocelulosa o nailon y se incuba con la sonda marcada.
2. Northern Blot: Similar al Southern Blot, pero se utiliza para detectar secuencias específicas de ARN.
3. Hibridación in situ: Permite la detección de secuencias de ADN o ARN directamente en tejidos o células, utilizando sondas marcadas que se visualizan mediante técnicas inmunohistoquímicas o de fluorescencia.

Electroforesis en Gel

La electroforesis en gel es una técnica fundamental para separar macromoléculas, como ácidos nucleicos y proteínas, en función de su tamaño y carga. Las moléculas de ADN, cargadas negativamente, migran a través de una matriz porosa (el gel) hacia el electrodo positivo cuando se aplica un campo eléctrico. Las moléculas más pequeñas se mueven más rápidamente a través del gel que las moléculas más grandes, lo que permite separarlas por tamaño. La visualización del ADN se realiza comúnmente tiñendo el gel con bromuro de etidio (un agente intercalante fluorescente) o utilizando otros colorantes fluorescentes más seguros.