Bioqui

5ª AULA: Caracterização da Enzima Uréase de Soja
Fundamento teórico: A uréase é uma enzima que catalisa a hidrólise da uréia em amônia e dióxido de carbono.
Reações:
Em meio aquoso: 2 NH3 + 2 H2O à 2 NH4OH
hidróxido de amônio
CO2 + H2O à H2CO3
ácido carbônico
H2CO3 + 2 NH4OH à (NH4) 2CO3 + 2H2O
carbonato de amônio
A atividade da enzima pode ser verificada pela formação de carbonato de amônio, que é um sal de reação básica e cuja presença pode ser revelada por meio de um indicador ácido básico como o vermelho de fenol (VF), por exemplo (VF em meio básico = rosa; VF em meio ácido ou neutro = amarelo).
A uréase existe em algumas bactérias e plantas e pode ser extraída com facilidade de soja.
Objetivo: observar a atividade da enzima uréase e a ação dos agentes desnaturantes sobre a enzima.
Extração: pesar cerca de 15g de farinha de soja e dissolver em 100 ml de água destilada. Deixar agitando durante 30 minutos. Filtrar com algodão. Desprezar o resíduo. O filtrado contém a uréase. Conservar em baixa temperatura.
Reativos:
Solução de uréase, reativo de biureto; solução de uréia 1% em tampão fosfato 0,01M; solução de tiouréia em tampão fosfato 0,01M; solução vermelho de fenol; solução de cloreto de mercúrio 5%; ácido nítrico concentrada.
Procedimento:
1) Reação do Biureto: Substâncias que contém duas ou mais ligações peptídicas dão reação de Biureto positiva. O íon cúprico fornecido pela solução de CuSO4 se complexa com os grupos (-NH) das ligações peptídicas desenvolvendo coloração violeta.
Teste: Tubo 1: 2 mL de água dest. + 10 gotas da solução de uréase + 2 mL do reativo biureto. Lilás (reage)
Tubo 2: 2 mL de água destilada + 2 mL do reativo biureto. Azul bebê (não reage)
Agitar os tubos e comparar a cor nos dois tubos e concluir o resultado.
2) Reação de Heller: Esta reação baseia-se na precipitação de proteínas por ácido forte.
Teste: Tubo 3: Colocar 5 gotas de solução de uréase e 2 mL de água destilada.
Agitar. Manter o tubo inclinado e juntar pela parede 1 mL de ácido nítrico concentrado,sem agitar e de modo que se formem duas fases. Observar se houve formação de anelbranco na interfase e concluir o resultado. Ocorreu o precipitado da proteína (reage) acima: branco abaixo: amarelo
3) Teste de atividade da enzima: Neste teste utiliza-se o indicador vermelho de fenol que, passa de cor amarela em meio ácido ou neutro, para cor vermelha em meio básico.
Teste: Tubo 4: Colocar 3 mL de sol. de uréia + 5 gotas de solução de uréase. Rosa + (há ativação catalítica)
Tubo 5: Colocar 3 mL de água destilada + 5 gotas de solução de uréase. Amarelo - (não há ativação catalítica)
A ambos os tubos adicionar uma gota de solução vermelho de fenol. Agitar e colocar em banho-maria a 37°C. Observar se há mudança de cor nos próximos 5 minutos. Concluir o resultado.
4) Desnaturação da enzima pelo calor: mais transparente que o tubo 3
Teste: Tubo 6: Colocar 2 mL de água destilada + 5 gotas de solução de uréase. Agitar e colocar em banho-maria a 100°C por 2 minutos. Em seguida adicionar 3 mL de solução de uréia e 1 gota da solução de vermelho de fenol. Misturar e aguardar 5 minutos em banho-maria
a 37°C. Observar se houve modificação de cor em relação ao teste 3. Ficou laranja em relação ao tubo 4; não houve reação catalítica; desnaturação da enzima.
5) Inibição de enzima por meio de mercúrio:
Teste: Tubo7: Colocar 2 mL de água destilada + 5 gotas da solução de uréase.
Agitar e juntar 5 gotas de cloreto de mercúrio 5%. Agitar e adicionar 3 mL de solução de
uréia + 2 gotas da solução de vermelho de fenol. Misturar e aguardar 5 minutos em banhomaria
a 37°C. Observar se houve mudança de cor em relação ao teste 3. Houve mudança em relação ao tubo 4; ficou amarelo com precipitado (brumos).