Análisis de la Funcionalidad de Linfocitos T, Fagocitos y Sistema del Complemento

Estudio de la Funcionalidad de los Linfocitos T, Fagocitos y Sistema del Complemento

Estudio de la funcionalidad de los linfocitos T

1. Estudio de proliferación en respuesta a mitógenos

Cuando los linfocitos T sensibilizados frente a un antígeno (Ag) se cultivan en presencia de ese Ag o de un agente mitógeno, se dividen activamente transformándose en linfoblastos. Esta proliferación de linfoblastos implica un aumento de ADN, que se puede medir si incorporamos una base marcada con un isotopo radiactivo (timidina tritiada).

El procedimiento sería el siguiente:

1. Separar los linfocitos mediante centrifugación con medio de Ficoll.
2. Lavar varias veces con un medio de cultivo celular.
3. Realizar un recuento y ajustar a una concentración determinada.
4. Dispensar en placas de microtitulación.
5. Incorporar la solución de Ag problema.
6. Incubar durante 72h a 37ºC.
7. Añadir la timidina tritiada e incubar.
8. Poner las células en contacto con un líquido de centelleo.
9. Establecer la tasa de proliferación comparando la radioactividad de las células estimuladas y la de las células control.

2. Estudio mediante citometría de flujo

Esta técnica también sirve para medir la proliferación celular.

3. Valoración de citoquinas

Se estudian en los sobrenadantes de cultivos estimulados con antígenos o mitógenos.

4. Pruebas de la hipersensibilidad cutánea retardada

Consiste en la inoculación intercutánea de una cantidad conocida de antígeno llamado PPD. Tras 48-72h se observa el sitio de inyección. La prueba se considera positiva si aparece una pápula de diámetro superior a 2mm. Un resultado negativo puede hacer sospechar de algún tipo de inmunodeficiencia.

Evaluación de la capacidad fagocítica

Se incuba una fracción del leucocito de sangre periférica con una suspensión de partículas inertes o de microorganismos para permitir la fagocitosis y posteriormente observarla y cuantificarla en una tinción. El inconveniente de esta técnica es que no distingue entre partículas fagocitadas o partículas adheridas a la superficie de la célula. También se puede aplicar la citometría de flujo en estos estudios marcando bacterias con un colorante fluorescente, resultando posible analizar el proceso de la fagocitosis.

Evaluación de la activación de los fagocitos

Se utiliza la prueba de reducción de NBT. Este método es sencillo para evaluar el “estallido respiratorio” que tiene lugar tras la activación de los fagocitos. El estallido respiratorio es inducido por proteínas de membrana y citoplasmáticas. Durante ese proceso de respiración se genera un ion superóxido que por la enzima superóxido dismutasa es transformado rápidamente en peróxido de hidrógeno. El NBT es un compuesto amarillo que una vez que puede ser endocitado por los fagocitos que hayan generado ese superóxido precipita en forma de cristales de color púrpura. Este cambio de color nos permite detectar los fagocitos que se han activado. En algunas inmunodeficiencias este sistema NADPH oxidasa está alterado.

Estudio del complemento

El sistema del complemento está formado por un conjunto de proteínas plasmáticas que se activan en cascada como consecuencia de distintos estímulos. Su función principal es producir la lisis de las membranas de las células de los agentes patógenos, aunque también tienen capacidad para promover los procesos inflamatorios, contribuir a la fagocitosis y la eliminación de los inmunocomplejos.

El sistema del complemento se puede activar por varias vías:

• Vía clásica: iniciada por anticuerpos IgM, IgG.
• Vía alternativa: iniciada por moléculas de la superficie de los patógenos.
• Vía de las lectinas: son moléculas de la superficie bacterianas.

Los defectos en el sistema del complemento producen situaciones patológicas como inmunodeficiencia o enfermedades autoinmunes. Cuando hay una disminución del complemento esto sucede: lupus eritematoso, glomerulonefritis, hepatitis, etc. Se produce un aumento del complemento en: ictericia obstructiva, artritis reumatoide, infarto agudo de miocardio, fiebre tifoidea, etc.