Selectividad de las bacterias por los colorantes de gram

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Un microorganismo es cualquier organismo unicelular solo visible al microscopio. Todas las Células tiene una membrana plasmática separada del medio externo material genético y una estructura denominada orgánulos que nos permite llevar a cabo diferentes funciones celulares el órgano más común en todas las células es  ribosomas que participa en la síntesis de proteínas .El medio celular interna es un medio acuoso llamado citosol o hialoplasma en el que se encuentran inmersos los orgánulos y estructuras celulares. Célula procariotas  se agrupan en bacteria y archaea(se caracteriza por presentar una pared celular que rodea a la membrana plasmática que protege a la célula es un componente clave para la tensión y clasificación de las bacterias )algunas células procariotas pueden tener otra capa de proteínas y polisacáridos que envuelve la pared celular yo nominado Cápsula la capsule a sirve de protección frente à la desecación y la fagicitosis . Mesosomas son las invaginaciones hacia el citoplasma que hay en la membrana plasmática. Características :En  las procariotas existe un nucloide  es una región en el citoplasma que contiene el cromosoma bacteriano. Plásmidos son pequeñas moléculas de ADN circular adicionales no esenciales para la supervivencia en ambientes no hostiles. Pueden presentar : Flagelos o Pili son apéndices alargados y un poco numerosos que están en involucrados en la movilidad celular, los pili están involucrados en la conjugación bacteriano forman un canal entre dos bacterias por el que hacen un intercambio de material genético. Transformación adquisición de ADN que ha quedado libre en el medio. Transducción transferencia de ADN de una célula a otra medida por un virus denominado bacteriófago o fago. Célula eucariotas tiene un núcleo que contiene el material genético separado del citoplasma mediante una envoltura nuclear. Orgánulos: retículo endoplasmático:están conectado con él y culo y se extiende hacia el citoplasma formado por el retículo endoplasmático liso donde se sintetiza lípidos y el retículo endoplasmático rugoso donde se sintetiza proteínas.Aparato de golgi: organiza el transporte intracelular y extracelular de moléculas. Mitocondrias: realizan la respiración celular que proporciona energía a la célula. Lisosomas: se encarga de la digestión celular de diversas sustancias.Citoesqueleto:son un conjunto de filamentos involucrados en el movimiento de sustancias en el interior celular y el movimiento celular. Vacuolas: se encargan de almacenar sustancias de la lisis enzimática del control del pH del tamaño celular son típicas en las células vegetales. Células eucariota animal: además de los organelos comunes tienen un centrosoma cercano al núcleo encargado de la organización de los filamentos del citoesqueleto.Célula eucariota vegetal: además de los organelos comunes presentan pared celular: una estructura rígida que rodea la membrana plasmática dando forma y protegiendo a la célula. Cloroplastos: en ellos tiene lugar la fotosíntesis que permite a la célula sintetizar materia orgánica a partir de CO2 H2O y energía luminosa. Las bacterias son microorganismos unicelulares procariotas de tamaño muy pequeño. La pared celular de las bacterias puede ser Gram positivo y gram negativo. Las bacterias Gram positivas tiene una pared celular de peptidoglicano en la tinción de Gram estás quedan de color violeta azul. Las bacterias Gram negativas poseen una delgada para celular de peptidoglicano y estaba ella otra membrana fosfolipídica que presenta lipoproteinas en la cara interior y lipopolisacaridos en la cara exterior la fina capa de peptidoglicano no retiene el tinte inicial y las bacterias quedan teñidas con el tinte de contraste que proporciona una coloración rosácea.Muchos libros polisacáridos de la membrana externa dan propiedad antigénica a las bacterias la parte más externa del lipopolisacarido se denomina antígeno 0,y permite la identificación de cepas de una misma especie mediante métodos serologicos clasificándolas en serogrupos. Ziehl-Neelsen es una tinción para identificar a las bacterias atípicas cuya pared bacteriana es muy rica en lípidos lo que las hace resistentes a ácidos y bases. Morfología y Agrupación celular: Cocos solas con forma redondeada frecuentemente estas bacterias pueden agruparse de dos en dos (diplococos)en cadenas (estreptococos) y en forma de racimos(estafilococos) o en forma de cubos (Sarcina) o de cuatro en cuatro  (tetradas).Basiloscélulas con forma de bastón alargado algunas bacterias adopta una forma intermedia entre coco y bacilo por lo que se les denomina cocobacilos las bacterias con forma de bacilo pueden agruparse formando filas de 2 (diplobacilos) o filas más alargadas (streptobacilos).Vibrios células con forma de coma .Espirilos células con forma de espiral. Espiroquetas células con forma serpenteante.Formación Endosporas estructuras altamente resistentes a condiciones ambientales físicas y químicas adversas algunas bacterias Gram positivas pueden formar las como el Bacillus. Esporogenesis formación de endosporas en el interior celular. El crecimiento bacteriano: se inicia conla captación de nutrientes del medio externo que dependerán del tipo del metabolismoque la bavteria sea capaz de llevar a cabo .Nutrición bacteriana:Bacterias nutricionalmente no exigentes( Pseudomonas Staphylococcus) bacterias nutricionalmente exigentes (Neisseria o Haemophilus) quieren  compuestos más complejos como vitaminas y cofactores para poder desarrollarse . Pueden clasificar en: Bacterias aerobias necesitan oxígeno bacterias anaerobias estrictas no pueden vivir en presencia de oxígeno bacterias anaerobias facultativas son capaces de soportar condiciones de anaerobiosis pero crecen  mejor en presencia de oxígeno bacterias microaerófilas crecen en presencia de pequeñas cantidades de oxígeno bacterias aerotolerantes crecen en presencia de oxígeno pero no la necesitan para vivir bacterias capnofílas son bacterias aerobias que además de oxígeno necesitan también la presencia de un 5-10% de CO2 para crecer. Clasificación según la temperatura: bacterias psicrofilas soportan bajas temperaturas entre 0 y 20 grados.Bacterias mesófilos crecen a temperaturas intermedias entre 20 y 40 grados . Bacterias termofilas soportan altas temperaturas de 55 grados o más.Bacterias estenotermicas solo crecer y sobreviven en rangos de estrellas de temperatura entre 35 y 36 grados.Bacterias euritermicas crecen en amplios rangos de temperatura entre 0 y 44 grados.Bacterias extremofilastienes en rangos de temperatura o muy bajas inferiores a 0 grados o muy altas superiores a 80 grados.Según el pH: bacterias neutrofilas el pH entre 5,5 y 8,0 acidofilas pH entre 0,0 y 5,5.Alcalofilas pH entre 8,0 y 11,5. Obtención de energía: respiración aeróbica (oxidación) la realizan tanto  bacterias aerobias cómo anaerobias facultativas cuando hay presencia de oxígeno en el medio las bacterias quimiorganotrofas realizan respiración aeróbica oxidan un compuesto orgánico en presencia de un aceptor externo de electrones el aceptor final es oxígeno molecular. Respiración anaerobicase lleva a cabo en ausencia de oxígeno la avisan tanto bacterias anaerobias estrictas cómo anaerobias facultativas cuando no hay presencia de oxígeno en el medio en este caso el aceptor final externo de electrones nunca es oxígeno molecular puede ser NO3 SO4 o CO3.Fermentación : ocurre en ausencia de oxígeno la avisan tanto bacterias anaerobias estrictas anaerobias facultativas el sustrato inicial la ruta también es la glucosa u otros azúcares mientras que los sustratos que actúan como aceptores finales de electrones son moléculas orgánicasen esta ruta interviene en la glucólisis seguido de degradación de piruvato.Técnicas de tinción: la tinción consiste en el uso de colorantes que permitan colorear determinadas estructuras que destacan del resto de los componentes de la muestra . Preparación del extendido la preparación de un frotis requiere  la utilización de una cantidad de muestra apropiado y la quede adecuadamente fijada al portaobjetos . Extencion de la muestra la muestra líquida se frota sobre la superficie del portaobjetos si la muestra se recibe en un hisopo si desea realizar también un cultivo a partir del hisopo es muy importante preparar el frotis tras la inoculación del medio de cultivo puesto que los portaobjetos no son estériles y el hisopo podría contaminarse.Fijacionde la muestra:fijación por calor se sitúa el portaobjetos sobre una placa caliente  60 grados durante 10 minutos hasta que se seque o pasar varias veces en elporta objetos  por la llama del mechero bunsenen ambos procedimientos el extendido deberá quedar siempre en la cara superior del portaobjetos.Fijación con metanol debe cubrirse el extendido con metanol al 95% durante un minuto después el portaobjetos se deja secar al aire.Tinciones para microscopia óptica :  las tinciones empleadas en microcobio óptico son cromogenicas que emplean colorantes (sustancias con una porción coloreadas denominado cromóforo).Clasificación de tinciones: tinciones simples solo se emplea un colorante y toda la muestra se tiñe del mismo color .Tinciones diferenciales más de un color debido a que se utilizan más de un colorante(Gram o Ziehl-Neelsen). Tinciones específicas se utilizan anticuerpos marcados con una molécula fluorescente para identificar una estructura celular en particular. Tinciones simples: mordiente es un aditivo qué se utiliza en tinciones simples para intensificar la coloración.La tinción de azul de metileno tiñe las bacterias de azul, el procedimienro es cubrir conla solución al 1 % la extensión previamente fijada dejar secar 2 minutos lavar con agua destilada y secar  a  tº ambiente .La tensión negativa con nigrosina los microorganismos se observan brillantes por contraste sobre un fondo teñido suele emplearse para observar bacterias con cápsula, esporas, flagelos.Tinciones diferenciales:tinción de Gram esta tinción permite clasificar las bacteras en dos grandes grupos grampositivas(captan el colorante básico y quedan de color violeta/azulado) y gramnegativas (captan el colorante de contraste y quedan de color rosa)Procedimiento :1 se pone el extendido en la solución de cristal Violeta durante un minuto a temperatura ambiente lavar con agua destilada el exceso y escurrir el portaobjetos.2 adicional como mordiente solución de yodo incubar un minuto a temperatura ambiente lavar con agua destilada y Escurrir el portaobjetos 3 añadir una solución de colorante de alcohol a cetona en proporción 1:1 elimina el cristal violeta solo de las bacterias Gram negativas dejar actuar solo 30 segundos lavar con agua destilada y escurir el portaobjetos 4 añadir safranina como colorante de contraste que teníra las de color rosa son las bacterias Gram negativas incubar 2 minutos a temperatura ambiente lavar bien con agua destilada escurrir el portaobjetos dejar secar al aire suvemente con papel.Tinción de Ziehl-Neelsen está tensión permite identificar bacterias ácido alcohol resistentes (conocidos como BAAR) procedimiento 1 cubrir el extendido con la solución del colorante primario carbolfucsina calentar el portaobjetos con la solución colorante sobre la mechero Bunsen casi hasta ebullición pero sí que llega a ella de modo que se observa liberaciones de vapores dejar enfriar 5 minutos y repetir al calentamiento dos o tres veces lavar con agua destilada y escurrir el portaobjetos 2 añadir en frío la solución de colorante de ácido clorhídrico /alcohol en 3 o 5% 5 x 2 minutos a temperatura ambiente escurrir y lavar con agua destilada escurir del portaobjetos sí en e primer escurrido se observa y continua desprendiéndose color rojo repetir el paso de decoloración a realizar la decolaración en frío Las ceras y los ácidos  micólicos de la pared de las BAARse habrán solidificado nuevamente y no dejarán salir el colorante en este paso al contrario que el resto de las bacterias que permite la  decoloración fácilmente por tanto las BAAR permanecerán teñidas de rojo y las bacterias no BAAR Se decoloran .3 cubrir el portaobjetos con solución de azul de metileno como colorante de contraste incubar un minuto a temperatura ambiente lavar con agua destilada dejar escurrir en posición vertical apoyando el portaobjetos sobre papel hasta que se seque al aire no secar presionando con el papel sobre el portaobjetos.Tinciones especiales: tinciones de cápsula se puede hacer con tinta China con tinción nigrosina o con la tinción de Hiss. La tensión de China las bacterias sin cápsulas se verán rojas sobre el fondo negro de tinta mientras que las bacterias con cápsula mostrarán un halo blanco en la tinción de Hiss  al visualizarlo  microscopio las bacterias sin capsula tendrán color violáceo y las cápsulas teñidas de azul muy pálido.Tinción de endosporas: las esporas son estructuras especiales que solo pueden ser formadaspor algunos géneros bacterianos, la técnica más utilizada para la observación microscópica de endosporas es la tinción wirtz-Conklin que tiene las esporas de color verde con el colorante verde malaquita al 5% se pasa por el mechero Bunsen 5 minutos luego se lava el colorante y se cubre con una solución acuosa de safranina al 0,5% se lava con agua y  se deja secar las esporas se detectan en color verde mientras que las células vegetativas se verán de color rojo.Tinción de flagelos las más habituale para su tinción es la de leifson en la que se emplea ácido tánico para recubrir el flagelo y aumentar su grosor luego se tiñe con solución de rosanilina para ver el flagelo de color rosa o azul.Método de la gota pendiente para detectar si hay movimiento celular gracias al flagelo , utiliza un portaobjetos excavado el procedimiento es el siguiente 1 depositar una gota de medio de cultivo en el centro  del cubreobjetos 2colocar múltiples gotas de aceite de inversión sobre los laterales y las esquinas del cubreobjetos invertirlo cuidadosamente colocarlo sobre el portaobjetos excavado de modo que la gota de medio quede justo sobre la excavación del portaobjetos sin llegar a tocarlo. Al microscopio se verán bacterias inmóviles que presentaran un movimiento qué consiste en una especie de vibración .Bacterías móviles que sedesplazan de un lado a otro dentro del campo microscópico.Técnicas de tinción para microscopia de fluorescencia: estas técnicas son capaces de visualizar muestras con concentraciones de microorganismos diez  veces menores que las necesarias en microscopia óptica,dos tipos: tinciones directas con fluorocromos y tinciones indirectas con inmunofluorescencia. Tinciones directa en esta técnica de tinción se establece una unión directa entre el fluorocromo y un componente de la célula bacteriana. Tinción de naranja de acridina el fluorocromo empleado es el naranja de acridina que se une a los ácidos nucleicos de forma inespecífica,el colorante se une al ADN de doble cadena emite fluorescencia de color verde y si se une al ADN de cadena sencilla o al ARN emite fluorescencia de color rojo.Esta técnica se suele utilizar para determinar bacterias con pared celular deficiente.Las bacterias y los núcleos emitirán fluorescencia brillante entre amarillo y naranja.Tinción de auramina-rodamina se emplea para la tensión de bacterias ácido alcohol resistentes por la afinidad que poseen los ácidos micolicos de sus paredes celulares por los fluorocromos auramina y rodamina esto se unen de manera inespecifica sin necesidad de proporcionar calor a los  micobacterias que emiten fluorescencia de color amarillo o anaranjado brillante sobre un fondo oscuro me permite diferenciar bacterias BAAR de las que no lo son. Tinciones indirectas los colorantes de fluorescentes se ligan con anticuerpos específicos nominados conjugado colorante-anticuerpo dichos conjugados se unen antígenos microbianos específicos lo que permite que se detecta mediante el microscopio de fluorescencia está técnica es valiosa ya que combina el alto contraste que proporcionar la fluorescencia con la alta especificidad de las uniones antígeno-anticuerpo,el fluorocromo más empleado para la conjugación con anticuerpos es el isotiocianato de fluoresceina (FITC) que emite fluorescencia intensa de color verde. Las técnicas de inmunofluorescencia se usan para detectar bacterias de crecimiento difícil o lento como Bordetella petussis ,chlamydia trachomatis. Usa también para identificar bacterias previamente cultivadas en virología y en ciertos casos en parasitología. Microscopio óptico: utiliza luz visible para observar las muestras la luz pasa a través de la muestra y posteriormente atraviesa varias lentes de aumento generando una imagen mucho mayor a la de la muestra. El aumento total alcanzado depende de las lentes utilizadas. La lente objetivo la más próxima a la nuestra de la mayoría de los microscopios ópticos puede aumentar el tamaño hasta 100 veces y la lente ocular más próxima al ojo aumenta 10 vecesla combinación de los dos lentes por porcióna es un aumento de 1000 que permite visualizar hongos la mayoría de las bacterias y parásitos pero no virus porque esto requiere un aumento de 100000. El poder de resolución está definido como la mínima distancia que puede distinguirse entre los objetivos aumentados . El poder de resolución determina la calidad la claridad la nitidez y el detalle de la imagen. Microscopio de campo claro en la cual se muestra las estructuras internas y el contorno de la cubierta externa. Microscopio de campo oscuro permite observar microorganismos vivos no visibles al microscopio de campo claro porque no se pueden teñir con métodos estándares con las que quedan distorsionadas por las tensiones se usa para observar el Treponema pallidum microscopio con contraste de fases permite observar de forma detallada estructuras internas en microorganismos vivos la imagen tiene zonas muy iluminadas y otras diferentes tonalidades de gris incluso negras se usa para la identificación de hongos.Microscopio invertido permite realizar observaciones de preparaciones realizadas mediante la técnica de gota pendiente para la observación de movimiento bacteriano.Microscopio de fluorescencia utilizan colorantes fluorescentes denominados fluorocromos qué pasa en un estado energético excitado cuando se ilumina con luz ultravioleta y al volver a su estado normal y libera el exceso de energía en forma de luz visible denominado florescente.Microscopio electrónico utiliza un haz de electrones para visualizar muestras utiliza lentes electromagnéticas para infocar los electrones sobre la muestra la imagen obtenida en blanco y negro pero tiene una resolución mayor que en los microscopios ópticos  dos tipos de microscopios electrónicos principales microscopio electrónico de transmisión que es para visualizar estructuras internas el microscopio electrónico de barrido empleado para la obtención de imágenes en 3D estructuras superficiales

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