Reaccion en cadena de la polimerasa pcr

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Kary Mullins da a conocer esta técnica en abril de 1983.

Concepto : Es un método sencillo para amplificar   fragmentos  de ácidos nucleicos .

E T A P A S :

  • Desnaturalización.- Incubar a temperatura (th)

   alta,  ( a 93 – 97º C ).

  • Anelación o Hibridación, con dos primers ó partidores complementarios a secuencias determinadas del DNA blanco que se desea amplificar (  a 50 – 65º C ).
  • Extensión o polimerización,  del cebador por actuación  de la DNA polimerasa,( 5’ → 3’ ) a

    72 º C. (Taq-polimerasa, Thermus aquaticus)

OPTIMIZACIÓN  DE PCR

  • Lograr una buena amplificación requiere optimizar las concentraciones individuales de cada componen- te de la reacción  y los parámetros de tiempo sobre temperatura.

COMPONENTES de la reacción :

  •  Muestra de ADN / DNA molde / templado
  •  Iniciadores / Primers / Partidores / Cebadores
  •  DNA Polimerasa
  •  Deoxinucleósidos trifosfato (dNTPs)
  •  Buffer o amortiguador de la reacción o Tampon PCR
  •  Sales,  proveen iones ( KCl y MgCl2 )

Muestra ADN o ARN  (mono o bicatenarios)

  •   Conocer el origen de la muestra y  el proceso   de extracción ( uso de EDTA-Fe, reduce la concentración de iones Mg++)
  •    Libre de proteínas (precipitan por calor)
  •    Libre de  fenol, detergentes y factores sanguíneos.
  •    Cantidad de muestra. El mínimo de 10 a 100        ng.     El máximo entre 400 – 500 ng.

Deoxinucleósidos-trifosfato (dNTPs)

  •  Concentración inicial de cada dNTP entre 50 y 200 µM.   4 -6 mM puede inhibir enzima Taq hasta 20 – 30% de actividad. 
  • Concentración de ión magnesio debe ser 0.5 – 1.0 mM 
  • Superior a la concentración de los 4 dN- TPs juntos (dCTP,dATP, dTTP, dGTP ).
  • Puede usarse dNTP marcadores:  biotin- 11 –dUTP, 7 – deasa – dGTP)

Tampón PCR

  • ( Cloruro potásico, gelatina, Tampón tris clorhídrico a PH 8.4, cloruro magnésico).
  • Cl2Mg varía entre 0.5 nM y 4 mM; específico para cada sistema. Debajo de 0.5 nM no se obtiene producto de amplificación, por encima de 4 mM se promueve la aparición de un producto no específico. 

Primers

  •  Oligonucleótidos de nomás de 30 bases; ideal entre 12 -25 b
  • Definen los extremos 5’ del fragmento amplificado. PCR puede amplificar varias KB pero se recomienda sea lo màs reducido posible..
  • Se debe evitar la complementariedad entre la pareja de iniciadores, especialmente  en sus extremos 3’ esto origina dímeros de primers (primers secundarios)
  • El contenido de G + C, cercano al 50% ; La relación máxima  pu/pi  será  60% / 40%.
  • Los extremos de las últimas bases debe ser G    o  C.
  • Su purificación debe llevarse a una concentración adecuada (entre 0.1- 1.0 µM).

 

Taq-DNA-Polimerasa

  • Tiene un peso de 94 Kda
  • Temperatura óptima de acción 75 -80ºC
  •  Vida Media : -   6 minutos a 97.5º ;

40    “        a 95ºC  ;

              130     “       a 92.5ºC

  • Actividad específica:  200,000 unidades/mg con una velocidad de extensión de:

150 nucleótidos/seg/mol de enzima a th.óptima

  24          “           “      “     “       “         a 55 ºC

                0.2         “           “      “     “       “         a 22 ºC

 

Otras polimerasas:

  • T4 DNA polimerasa (E.coli)
  • DNA polimerasa dependiente de RNA (retrovirus)
  • Pfu polimerasa de Pyrococcus furiosus
  • Tli polimerasa de Thermococcus litoralis
  • ( ventana de ventilación de submarino)
  • Pfx;  Pwo : Pyrococus woesei;  Tth.
  • Sus VENTAJAS
  • Alta  sensibilidad : detección de mutaciones y de agentes patógenos
  • Alta especificidad : diagnóstico pre-implan tacional (in vitro) y prenatal.
  • Permite trabajar con material de archivo : secuenciación de DNAs fósiles.
  • No requiere utilizar isótopos radioactivos : identificación de especies y control de cruzas entre animales.

 

  • VARIACIONES DE LA TECNICA BASICA
  • PCR MULTIPLE
  • PCR ARBITTRARIA
  • PCR ASIMÉTRICA
  • PCR IN SITU
  • PCR INTERNA
  • PCR INVERSA
  • PCR EN TIEMPO REAL

 

  • PCR EN TIEMPO REAL : -  Su principal característica es que permite cuantificar la cantidad de ADN o ARN presentes en la muestra original.
  • Se puede dividir en las técnicas basadas en fluorocromos no específicos y técnicas que usan sondas específicas.
  • En las técnicas basadas en fluorocromos, el ADN, que ve multiplicada su cantidad con cada ciclo se une al fluo rocromo (generalmente SYBR Green) produciendo fluorescencia que es medida por el termociclador apto para Real Time PCR. Permite cuantificar sólo una secuen cia por reacción pero tiene la ventaja de utilizar primers normales para su realización. Es mucho mas económica que la realización de Realtime PCR con sondas específicas
  • Usos de la PCR
  • Huella genética
  • Test de Paternidad
  • Diagnóstico de enfermedades hereditarias
  • Clonación de genes
  • Mutagénesis
  • Análisis de ADN fósil
  • Genotipado de mutaciones específicas
  • Identificación de especies

TECNICA SOUTHERNBLOT

Cómo se identifican los genes a estudiar?

  • Mediante la técnica de los borrones que puede orientarse a rastrear genes sea en la forma de ADN, ARN o sus productos: las proteínas. Consiste en una electroforesis seguida de transferencia y emplean se cuencias específicas (sondas) complementarias a la molécula de ácido nucleico a identificar. Es decir, ambas utilizan la hibridación de ácidos nucleicos para la detección de las moléculas buscadas. Los princi- pios generales son los mismos, pero hay diferencias en el procedimiento debidas principalmente a que el ARN se degrada mucho más fácilmente que el ADN; esto hace necesario tomar muchas más precauciones.
  • Una vez sembradas las muestras en un gel, se realiza una corrida electroforética hasta lograr que las moléculas se separen por tamaños de manera tal que se puedan distinguir las buscadas. Luego se transfieren los ácidos nucleicos del gel a la membrana. De esta manera los que quedan retenidos pueden ser sometidos a ensayos de hibridación con sondas específicas para detectar la presencia de determinadas secuencias.
  • Hibridación

Se refiere a uno de los tipos más comunes de técnicas usadas por los genetistas y los biólogos moleculares para estudiar el ADN y el ARN aprovechando las características de la doble hélice del ADN, en donde cadenas complementarias de ADN se aparean para constituir la doble hélice. Así, empleando fragmentos de ADN o sondas de cadena sencilla marcada con una molécula trazadora, los investigadores podemos hacer experimentos en el laboratorio que nos permiten identificar el par complementario de la sonda en una mezcla complejade material genético

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