Mutaciones:

Clave bilogía molecular

MUTACIONES:

•   Variabilidad Capacidad de los organismos de reproducirse en forma hasta cierto  pun Diferentes a ellos

Modificaciones (Reflejan la capacidad de adaptación): ….

• Son masivas
• Son reversibles
• Son respuesta a nuevas condiciones de vida
• -No se heredan

Mutaciones  (Cambios cualita tivos y cuantitativos):

• Son repentinas e  individuales
•  No son reversibles
•  Se transmiten a las generaciones siguientes

 Mutaciones Clasificación:..

Según el origen :

• Naturales o espontáneas, ocurren            normalmente.
  • Artificiales, o Inducidas por agentes físicos y/o químicos, provocadas por la mano del hombre

II  Según  su efecto sobre la capacidad    de adaptación y fertilidad del organismo (selección natural) :

-  Positivas     ;        - Neutrales     ;  y

-  Negativas (Letales/Deletéreas)

III  Según su dirección :

- Directa: Del gen A à a

- Inversa : Del mut. a àA

IV  Según eltipo celular:

• Somáticas, afectan al individuo pero no son hereditarias.
  • Germinales, se presentan en las células sexuales.

• V   mutaciones Basada en su efecto
  • Morfológicas, se detectan a simple vista.
  •    Bioquímicas, se detectan usando  pruebas.
  •    De regulación, de genes.
  •    De comportamiento  ;  y
  •   Condicionales  su expresión depende del ambiente
• VI Según la naturaleza de los cambios de estructuras :

1.  Micromutaciones o mutaciones  puntuales         

                            1.1  Transición, cambio de una pu x pu   ó pi x pi  (sustitución de bases).

                            1.2  Transversión, cambio de una purina por una pirimidina (sustit.de bases).

                            1.3   Adición o inserción de uno más nucleótido(s)

                            1.4   Deleción o pérdida de 1 ó + nucleó tidos.

Sustitución de bases

 Anemia falciforme o “Sickle cell” anemia

• Forma falciforme de los glóbulos rojos
  • ác. Glutámico es sustituido por Valina debido a una sustitución de bases.

• Sustitución de bases:
  • Cuando se es heterocigoto (Ss) para la condición se puede sobrevivir, hay codominancia (ambos alelos se expresan)
  • Cuando se es homocigoto recesivo (ss) es más difícil pero con tratamientos (transfusiones de sangre) se puede sobrevivir más tiempo.
  • Daño al corazón, hígado, anemia severa

• Macromutaciones (en células sexuales) o Aberraciones Cromo sómicas.

 2.1  Euploidías, incrementos o disminuciones por genomios com pletos: n (monoploidía/haploidía), 2n (diploidía), 3n (triploidía), 4n, 5n, etc ( - a partir de 3 genomios a más: poliploidía; - alopoliploidía, ge nomios de organismos diferentes)

2.2  Aneuploidias

        Incremento o disminución en número    menor a un genomio.

•     Monosomía  (Fórmula : 2n – 1)

                Cuando pierde un cromosoma completo.

•     Nulisomía  (Fórmula : 2n – 2)

   Cuando pierde un par de cromosomas   completos.

   Trisomía (Fórmula : 2n + 1)

   Cuando tiene un cromosoma de más

• Tetrasomía (Fórmula : 2n – 2)
• Cuando el organismo tiene dos cromoso mas homólogos demás.
• Doble trisómico (Fórmula: 2n + 1 + 1)
• Cuando el organismo tiene dos cromoso mas no homólogos demás.

2.3  Cambio en estructura de un cromosoma    por pérdida, duplicación o cambio    estructural de uno ó varios genes: Deleción, Duplicación, Inversión, Translo-                         cación, Isocromosoma, anillo, etc.

• Deleción, ( d ) pérdida de un segmento cro mosómico que puede ser terminal o interca lar . Ej.           Síndrome de Cry-du-chat (-5p)
• Inversión (inv), cuando un bloque  de genes de un cromosoma rota 180º. Puede ser:
• Inversión

• I. Pericéntrica, cuando compromete al centrómero

I. Paracéntrica, aquella inversión que no compromete al centrómero.

Duplicaciones,( d ) se originan por repe ticiones  de (trinucleótidos hasta) genes completos.   Ej. Distrofia de Duchenne.

Isocromosoma, (i) se originan por duplicación en la fase S, seguida de deleción doble y suelde en los extremos con deleción.  

• Anillo, ( r ) forma un cromosoma cuando pierde sus extremos teloméricos y sufre suelde en los extremos quebrados.
• Traslaciones, ocurren con tres roturas en el mis mo cromosoma, con migración de un segmento

  y su reinserción en la 3a. rotura. (ins)

• Traslocaciones (t), se refiere al intercambio de segmentos cromosómicos y puede ser:

1.  Recíproca, si el intercambio ocurre luego de   una rotura y suelde de segmentos intercambia- dos entre dos cromosomas  que pueden ser ho mólogos o no.

2. Robertsoniana, que a su vez puede ser:

2.1 Cuando las quiebras ocurren en el brazo corto

  de un cromosoma y en el brazo largo del otro cromosoma.

2.2 Si la quiebra ocurre en el brazo corto de ambos cromosomas y luego se sueldan los restos quedando un cromosoma con dos centrómeros, uno de los cuales se inactiva.

• Inserción (ins), cuando un segmento de cromosoma  migra y se inserta en la rotura de otro cromosoma; igual que las traslaciones se representa con “ins”

• Agentes mutágenos.

 Son capaces de inducir mutaciones

1. Agentes físicos, originan aberraciones cromo-

    sómicas, mayormente deletéreas. Clases:

                       1.1 Radiaciones electromagnèticas:

                             -  Radiaciones ionizantes, Ejm.

                                                 Rayos X ( > mut. Letales)

                                                 Rayos gamma (Co⁶⁰ , Cs¹³⁷)

                                                 similares a los rayos X

- Radiaciones no ionizantes

         Los rayos ultravioleta, se usan  para polen, bacterias, esporas  y otros microorganismos.

• 1.2 Radiaciones Corpusculares, son haces

    de partículas atómicas, viajan a velo  cidades menores de la luz. Ej. Neu-

    trones y protones.

• 2.  Agentes químicos
  •  Son más efectivos que los físicos. Tienen mejor nivel de especificidad para ataque y corte.
  • Originan principalmente mutaciones génicas.
  • Clasificación según su mecanismo de acción:
  • 1.  Sustancias alquilantes, capaces de ceder                 grupos alquilos (CH3, C2 H5, NH, etc) al

    N, O ó S del ADN. ARN o proteínas (logrando apurinar nucleótidos o esterificar –

        grupos fosfato del gen). Ejm. EMS

• 2. Inhibidores de bases nitrogenadas como la cafeína, la teobromina y el etil uretano, que facilitan el cambio de enlaces simples a dobles

   y consiguiente tautomerización de las bases nitrogenadas, y enlaces incorrectos  de éstas.

• 3.  Oxidantes, desoxidantes y radicales libres.
•  Acido nitroso, aldehidos, peróxidos, sales de metales pesados, oxígeno y otros. Causan daños como la desaminación y replicación incorrecta del ADN                       
• 4. Antimetabolitos, principalmente análogos de bases que modifican el proceso normal de re- plicacìón del DNA. Ej. La 2-aminopurina, el 5- bromouracilo, la 5-desoxiuridina
• G = C à G = BU   à  A=BU  à  A = T
• 5. Colorantes de propiedades alcalinas como

   Las acridinas y proflavinas que forman comple jo con ADN y ARN respectivamente, originan do variaciones en la lectura del código gené tico.

• Tasa de mutación

   Frecuencia relativa con que se produce una mutación en un locus dado en una población; dada por lo general como el número de sucesos por gen y generación.

.Tasa de reversión

                       Frecuencia relativa con la que una mutación determinada retorna al estado silvestre, dada en porcentaje con relación a la tasa de mutación.

• KNOCKOUT GÉNICO
• Reemplazo de un gen en un organismo vivo.
• Organismo knockout, el que sufrió un reem plazo de esta naturaleza.
• TRANSGEN
• Gen insertado a un organismo al que no se le

   alteró sus propias copias normales.

• TRANSPOSONES
• O elementos genéticos transponibles, grupo de

   Unidades genéticas que pueden moverse, o

                       “transponerse”, por el genoma.

• CROMOSOMOPATÍAS COMUNES:
• - SÍNDROME DOWN : 47, XX, + 21
• -                         “         PATAU : 47, XY, + 13
• -                         “                     CRY-DU-CHAT : 46, XX, - 5 p
• -                          “         EDWARDS : 47, XY, + 18
• -                         “                     TURNER : 45, X0
• -                          “                     KLINEFELTER : 47, XXY
• OTRAS:
• - SINDROME DE X – FRAGIL : 46, XX, ( r ) X

2SECUENCIACION DEL ADN

El primer ácido nucleico secuenciado fue el t-RNA de alanina que tiene 76 nucleótidos. Las enzimas utilizadas fueron la ribonucleasa T1 y  fosfodiesterasas del bazo (remueve terminal 5’)  y del veneno de serpiente (   ”      3’ terminal). Los fragmentos resultantes fueron identificados por electroforesis o por cromatografía.

•    El descubrimiento de la ER y el desarrollo de la técnica de clonación molecular del DNA, han permitido mejorar y avanzar las técnicas de secuenciamiento del DNA.

La estrategia para secuenciar ácidos nucleicos en general comprende

   a)  El fraccionamiento de los polinucleótidos en fragmentos lo suficientemente   pequeños para ser totalmente secuenciados; b)  secuenciación de los fragmentos;

  c)  repetir a) y b) pero produciendo cortes  alternativos que rebasen los puntos de   escisión de la primera colección;

 d) Ordenamiento de los fragmentos super   poniendo los fragmentos obtenidos en   ambos fraccionamientos.

• La estrategia de secuenciamiento antes señalada la comparten los métodos químico y enzimático. Las ventajas del segundo han superado largamente  al método químico y mejorado por el uso de fluorocromos distintos para cada tipo de nucleótido, luego automatizado ha permi tido el secuenciamiento de los genomas de muchos organismos.

• Los fragmentos generados se separan por electroforesis en geles de acrilamida que permiten diferenciar tamaños de fragmen tos escindidos en una sola base.

Las bandas que muestra el gel correspon den a moléculas de longitud decreciente y forman una escalera que permite ordenar los nucleótidos de forma consecutiva.

• El Método Enzimático o de Sanger:
• Utiliza DNA desnaturalizado, la hebra que se desea secuenciar sirve como molde.
•  Un cebador, complementario y específico  para la secuencia estudiada, marcado radioactivamente.
• Los cuatro deoxinucleósidos trifosfatos. Y se divide en cuatro alícuotas, a cada una de las cuales se añade un dideoxinucleó sido trifosfato conocido.
• Fragmento Klenow de la polimerasa I o la secuenasa.
• La síntesis se lleva a cabo en dos pasos:

1º  El cebador se alarga usando los 4 deoxinu cleósidos trifosfato, incluído el dATP marcado con P32

2º  Se produce la terminación de cadena por el dideoxinucleósido trifosfato añadido en pequeña cantidad.

• El resultado en cada tubo es una colección de fragmentos de tantos tamaños como veces presente esté la base estudiada.
• El análisis  por electroforesis en gel de acrilami- da nos dará la secuencia complementaria del gen o segmento de DNA en estudio.

USO DE FLUOROCROMOS:

• Su uso elimina la radioactividad y permite automatizar la última parte del proceso.
• El uso de un solo fluorocromo Tetrametil rodamina para marcar los cebadores y luego “leer” el gel corrido con un rayo laser
• Usar cuatro fluorocromos, uno para cada base: NBD (4-cloro-7nitrobenceno-2-oxaldiazol), tetra metilrodamina, fluoresceína y rojo de Texas, por su diferente longitud de onda, son registrados directamente en la computadora.

. Aplicaciones de la secuenciación de ADN:

Detección de mutaciones

Método de diagnóstico rutinario (relación entre enfermedad y mutación puntual)

Secuenciación de ADNs fósile

  Posibilidad de aislar secuencias de ADN a partir de unas pocas copias (la mayoría  están dañadas o degradadas)

Diagnóstico de enfermedades genéticas

Diagnóstico prenatal / Diagnóstico preimplantación de enfermedades hereditarias o determinación del sexo del feto previamente a su implantación en procesos de fecundación in vitro

Identificación de especies y control de cruces entre animales

 Para descubrir fraudes comerciales, tales como vender carne de una especie más   barata a los precios de otra más cara, o el comercio ilegal de especies en peligro

Secuenciación de genomas

  Conocimiento básico y aplicado de diferentes organismos (incluido el genoma humano)

• Aplicaciones de la secuenciación de ADN
  • • Detección de mutaciones

Método de diagnóstico rutinario (relación entre enfermedad y mutación puntual)

• Secuenciación de ADNs fósiles

      Posibilidad de aislar secuencias de ADN a partir de unas pocas copias (la mayoría

      están dañadas o degradadas)

• Diagnóstico de enfermedades genéticas

Diagnóstico prenatal / Diagnóstico preimplantación de enfermedades hereditarias o determinación del sexo del feto previamente a su implantación en procesos de

fecundación in vitro

• Identificación de especies y control de cruces entre animales

    Para descubrir fraudes comerciales, tales como vender carne de una especie más  

     barata a los precios de otra más cara, o el comercio ilegal de especies en peligro

• Secuenciación de genomas

     Conocimiento básico y aplicado de diferentes organismos (incluido el genoma humano)

SECUENCIACION POR HIBRIDACION

• Varios grupos de investigadores entre 1991 y    1993 comienzan a construir verdaderos chips de ADN sobre vidrio modificado o propileno.
•  Para reconstruir una secuencia desconocida es necesario construir un chip con todas las posi-bles combinaciones de nucleótidos  conocidos, con los que pueda hibridarse específicamente.
• También se puede fijar al soporte la secuencia desconocida e hibridar sucesivamente el chip con oligonucleótidos de secuencias conocidas, radioactivas o fluorescentes.
• Útil para identificar mensajeros, polimorfismos, mutaciones hasta del tipo de sustitución de una base.